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正常及宫颈上皮内瘤变妇女中高危型HPV16型感染载量分析

收录时间:2015-12-21 CLICKS:
  【摘要】目的:联合第二代杂交捕获技术(HC2)、聚合酶链反应(PCR)与液基细胞学技术检测HR-HPV16型载量在正常及不同级别宫颈病变分布,探讨不同程度宫颈病变患者中HR-HPV16载量分布。方法:收集唐山武警医院妇产科门诊778例妇女的宫颈脱落细胞进行细胞学检测,同时运用HC2和PCR技术检测HR-HPV16型载量,分析HPV16病毒载量与子宫颈病变级别的关系。结果:在778名女性中,HR-HPV感染率为40.1%,在正常、ASCUS/ASC-H、LSIL与HSIL中,HR-HPV感染率依次为12.8%、45.2%、68.8%和97.8%;HPV16型总感染为13.8%,在正常、ASCUS/ASC-H、LSIL与HSIL中,HPV16型感染率依次为2.8%、17.5%、18.5%与45.9%。HR-HPV感染率随病变升级而增加;HPV16型在HR-HPV感染中所占比例为34.3%。在正常及CIN中,HPV16 DNA病毒载量随病变升级而呈递增趋势。结论:HPV16型感染率及其病毒载量随宫颈病变进展而呈递增趋势,持续性高病毒载量能够预测宫颈病变进展。
  【关键词】人乳头瘤病毒;宫颈上皮内瘤变;第二代杂交捕获
  【中国图书分类号】R711.74
  The analysis of high-risk  infection HPV16  viral load  on normal cervix and cervical intraepithelial neoplasia of woman
  LU ping,CHENG Xiaobin,ZHAO Junjian,BAI jie,JING Bowen.Integrated Department,General Hospital of Armed Poloce Forces,Tangshan,Hebei 063004,China
  [Abstract ] Objective  To detect the   distribution of the high-risk HPV( HR-HPV16  ) viral load  in normal cervix and different grade  cervical intraepithelial neoplasia by combined second generation of hybrid capture technology(HC2),polymerize chain reaction(PCR) , liquid-based cytology technology(LCT), and  discuss their relations. Method The cervical exfoliated cells of 778 women in gynaecology and obstetrics department of Tangshan Armed Police Forces Hospital were performed cytologic examination , HR-HPV16 viral load was detect with  HC2 and PCR., and analysis the relation between  HPV16 viral load  and cervical lesions. Results In 778 cases of women, The infection rate of  HR-HPV was  40.1%,Among the  normal, atypical squamous cell of undetermined significance (ASCUS/ASC-H), Low-grade Squamous Intraepithelial Lesion(LSIL) and high-grade squamous intraepithelial lesion(HSIL), The infection rate of  HR-HPV was 12.8%、45.2%、68.8%and 97.8%.The total infection rate of HPV16 was 13.8%. Among the  normal, ASCUS/ASC-H, LSIL, and HSIL ,The total infection rate of HPV16 was  2.8%,17.5%,18.5 and 45.9%. The HR-HPV infection rate increased with lesion grade. The infection rate  of HPV16 in HR-HPV was 34.3%. HPV16DNA viral load in the nomal and CIN was increased with lesion grade. Conclusion The infection rate  and  viral load of  HPV16 were increased with lesion grade, Persistence of high viral load can Predict  the progress of cervical lesions.
  [key word]  human papilloma virus <javascript:showjdsw(showjd_0,j_0)>(HPV);cervical intraepithelial neoplasia(CIN); second generation of hybrid capture
  世界范围内宫颈癌发病率居妇女恶性肿瘤第二位,仅次于乳腺癌。大量流行病学和病原学研究表明,高危型人乳头瘤病毒(High-Risk human papillomavirus,HR-HPV)持续性感染是引起宫颈癌前病变及宫颈癌的必要条件[1-3],而HPV阴性妇女患宫颈癌的风险几乎为零[4-5]。在宫颈癌及癌前病变中,以HPV 16型最为常见,HPV16型感染往往预示着更高的患病风险。本研究以我院门诊就诊妇女为研究对象,通过宫颈脱落细胞学检测,HC2以及PCR技术,探讨了不同级别宫颈病变患者中,HPV感染状况以及HPV16型载量分布特点。
  1、资料与方法
  1.1资料来源 收集2008年6月-2011年6月在唐山武警医院妇科门诊常规进行宫颈液基细胞学(TCT)检查778女性作为研究对象,并对其进行HC2-HPV检测。患者年龄19-72岁,平均年龄为41.2±10.6岁。
  1.2宫颈细胞学检查 用ThinPrep专用细胞刷插入宫颈管口并旋转3-5周收集宫颈外口及宫颈管的脱落细胞,细胞刷放入装有ThinPrep保存液的小瓶中洗下脱落细胞,由ThinPrep自动制片机制片,由专门细胞学医师阅片,采用2001年国际肿瘤协会推荐的TBS(The Bethesda Systerm)诊断系统进行描述。
  1.3 HC2检测HR-HPV DNA病毒载量 将专用锥形采样刷置于宫颈管内,旋转3周,将采样刷放入专门的标本储存瓶内,沿折痕折断采样刷多余杆部,盖好盖子,采用美国Digene 公司提供的第二代杂交捕获技术,对13种高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型)载量进行检测。样本产生的光表达为相对光单位(Relative Light Unit, RLU),通过其与设置的标准阳性对照(PC)之比来判定结果。当比值≥1.00时,认为HR-HPV检测阳性,比值越高,样本中HR-HPV DNA 载量越高。
  1.4聚合酶链反应(PCR)技术检测HPV16型感染  利用HC2检测剩余样本,提取DNA,取上清2ul为模板加入反应管中,HPV16引物序列为上游5-ATGCACCA AAAGAGAACTGCAA-3,下游5-TTACAGCTGGGTTTCTCTACGTGT -3,β-actin引物序列为上游5-tcaccaactgggacgaca-3,下游序列5-acagcctggatag caacg- 3,反应条件为94℃变性5min,35个循环,72℃,30s,52℃,30s,72℃,30s,共30个循环,最后一次循环后72℃延伸5min。每次扩增均设阳性和阴性对照。PCR产物于1.2%琼脂凝胶电泳,100V,15min。在凝胶成像仪中观察凝胶,在紫外灯下被溴化乙锭染色的DNA呈现明亮红橙色荧光,β-actin出现相应条带提示DNA提取合格,HPV16产物与阳性对照出现在同一水平位置上,则认为为阳性,即HPV16型感染,否则为阴性。
  1.5统计学处理 应用SPSS10.0统计软件进行x?检验。
  2、结果
  2.1、HR-HPV感染状况 在778例样本中,细胞学正常为397例,细胞学异常为381例,其中ASC为126例,LSIL为157例,HSIL为98例。HC2检出高危HPV感染为312例,HPV阳性率为40.1%。在397例宫颈脱落细胞学正常女性中,高危型HPV阳性率为12.8%,在ASC-US/ASC-H中,高危型HPV阳性率为45.2%,在LSIL与HSIL中,高危型HPV阳性率分别为68.8%、97.8%,随病变升级,高危型HPV阳性率逐步上升,与正常妇女相比,均具显著性差异(P <0.01)。
  2.2、HPV16型在细胞学中分布 HPV16型共检出107例,感染率为13.8%,占HPV感染的34.3%。在细胞学正常妇女中HPV16型感染率为2.8%,占HR-HPV感染比例的21.6%。在ASC-US\ASC-H中, HPV16型感染率为17.5%,所占比例为38.6%,在LSIL与HSIL中,HPV16型感染率为分别为18.5%与45.9%,所占比例分别为26.8%、46.9%。HPV16型感染率在CIN与正常女性中均具有显著差异,HPV16感染所占比例在HR-HPV阳性患者中所占比例与正常妇女相比,仅LSIL与HSIL具有显著性差异(P<0.05),在HSIL中,HPV16型所占比例最高,为46.9%。
  表一、 不同级别宫颈病变中高危型HPV与HPV16型分布情况
  细胞学结果     例数   HC2阳性(b/a %)  P  HPV16阳性(c/b %)(c/a%)  P                 a              b                  c
  Normal       397       51(12.8)      -      11 (21.6)(2.8)          - ASC-US/ASC-H   126      57 (45.2)      <0.01   22(38.6)(17.5)     >0.05 LSIL         157       108(68.8)    <0.01   29(26.8)(18.5)       <0.05 HSIL         98        96(97.8)      <0.01   45(46.9)(45.9)    <0.05 合计         778       312(40.1)     -      107(34.3)(13.8)      -
  2.3、HPV16 DNA载量在细胞学中分布 在正常脱落细胞以及各级病变中,HPV16型载量均呈现较大幅度的波动。细胞学正常女性中,HPV16DNA载量平均数为327.5pg/ul,ASC-US/ASC-H中,其平均数升至431.4 pg/ul,在LSIL与HSIL中,HPV16 DNA载量平均数分别为522.8 pg/ul、657.9 pg/ul。随病变升级,HPV16 DNA病毒载量呈递增趋势。
  表二、 不同级别宫颈病变中HPV16 DNA载量分布情况
  细胞学结果   HPV16阳性+HC2阳性                   例数HPV16DNA载量  (pg/ul)
  平均数±标准差       中位数
  正常             7                327.5±123.5          217.5 ASC-US\ASC-H      21                 431.4±217.6          478.1 LSIL            24                522.8±173.2          439.7 HSIL            43                657.9±231.8          522.8
  3、讨论
  研究表明,宫颈癌的发生发展是一个长期的、由量变到质变、渐变到突变的过程,HPV感染与宫颈癌的发生密切相关,大部分宫颈癌样本中可检测到HPV病毒基因组或基因片段,90%以上的宫颈癌合并HPV感染[6-7]。临床研究显示,高危型HPV阳性的CIN患者具有两种不同结局,一是机体免疫使清除HPV,病变自然消退,另一种是HPV持续性感染,CIN发展为宫颈癌。本研究检测了正常以及CIN患者中高危型HPV感染情况,发现高危型HPV感染率随宫颈病变加重而增加,与国外文献报道具有一致性,再次证实了在宫颈癌的发生发展过程中高危型HPV感染所起的关键作用。
  HPV基因型分布存在明显地域差异,近年来,已鉴定出120多种HPV基因亚型,约40型可侵犯生殖道,依据其致癌能力强弱分为低危型与高危型,低危型多引起外生殖器尖锐湿疣而高危型则与CIN和宫颈癌相关,目前其中至少16型高危型HPV与子宫颈癌有关。尽管不同地区HPV流行类型各有不同,但世界范围内共同的高危型HPV感染以16型为主,在国际癌症研究协会(IARC)最新报道的多中心研究中HPV16型在所有HPV阳性的宫颈癌患者中平均感染率约占50%以上[8-9]。国内有研究表明,在我国HPV感染亦以HPV16型为主,其感染率约为31.43%,其次为HPV58、18、33、31。。我们的研究显示,HPV16型感染在高危型HPV感染中所占比例为34.3%。且有研究显示,在高危型HPV感染中,以HPV16型感染与宫颈癌关系最为密切。本研究结果也证实不同程度宫颈病变患者中,HPV16型感染率随病变升级而增加。在正常、LSIL与HSIL中,HPV16型感染所占比例依次为21.6%、26.8%与46.9%,且与正常组相比较,LSIL与HSIL均具有显著性差异,(P<0.05)。但在ASC-US/ASC-H组,HPV16型感染比例为38.6%高于正常及LSIL组,这可能与ASC-US/ASC-H组中存在难以被鉴定宫颈高级别病变有关。
  大量研究指出,高病毒载量也许可作为一种能够预测妇女向高级别病变进展的标记物[10-12],也有研究指出,在宫颈细胞学正常的女性中,高病毒载量作为高风险因子能够预测宫颈上皮内瘤变的进展。关于采用不同方法检测HPV-DNA含量与宫颈病变严重程度的关系尚存在争议,有文献报道HC2检测HR-HPV DNA含量与宫颈病变严重程度不相关,但也有资料显示,两者间存在相关性。为了明确HPV与宫颈癌进展的关系,我们评估了95例HPV16型感染妇女在正常及CIN组中病毒拷贝数的变化,发现在HSIL中,病毒载量较高,而在正常组,病毒载量较低,即HPV16 DNA载量随病变升级而呈递增趋势,这种剂量效应的趋势预示HPV16型感染病毒DNA拷贝数与宫颈癌前病变的进展密切相关,说明宫颈HPV16 DNA含量可能促进宫颈从慢性炎症状态逐步发展到宫颈癌前病变(CIN),进而进展为宫颈癌。因此,从病毒感染到出现细胞形态学改变,HPV负荷持续较高水平,并逐渐由量变到质变,提示病毒负荷量与体内免疫系统抗衡的过程,而感染HPV病毒负荷量越高,病变进展为CIN的可能性越大。Gravitt等也提出HPV16 DNA平均拷贝数随CIN级别加重有显著的升高,但在其他型别的HPV感染中却未见这种趋势[13-14]。因此,持续性HPV16高病毒载量将预示高级别宫颈病变的发生。
  在对HPV16型病毒载量分析中本研究尚存在不足,部分HPV16阳性患者中混杂其它型别HPV感染,我们的研究只能对HPV16型及含有HPV16型感染的混合感染进行定量,因此不能对单一HPV16型DNA精确定量。对于检测HPV感染型别及病毒载量,在宫颈持续性HPV感染的女性中具有较高的预示性作用,对于制定临床处理方案以及治疗后的随访具有指导意义,因此,我们尚需进一步改进检测技术并且对HPV阳性患者进行随访,观察HPV感染转归与宫颈细胞的变化情况,有利于我们进一步了解HPV型别和载量在宫颈癌进展中的关键作用。
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