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微小RNA miR-181a促进慢性粒细胞白血病K562细胞分化

收录时间:2015-12-21 CLICKS:
  【摘要】  目的  探讨微小RNA miR-181a在慢性粒细胞白血病(CML) K562细胞中的功能。方法  构建了miR-181a过表达的慢病毒载体,通过观察CD235a和γ球蛋白的表达评价K562细胞向红系分化的程度,观察CD61和CD41的表达评价K562细胞向巨核系分化的程度,它们表达水平的检测均采用实时定量PCR方法。通过CCK实验检测细胞增殖情况。结果  氯高铁血红素佛及波酯诱导后,miR-181a在K562细胞中过表达能够增强CD235a、γ球蛋白、CD61和CD41的表达水平(P<0.05);miR-181a过表达能够明显抑制K562细胞的增殖(P<0.05)。结论  miR-181a过表达促进K562细胞的分化并抑制其细胞的增殖。
  【关键词】  miR-181a;K562细胞;分化;增殖
  MicroRNA miR-181a promotes the differentiation of chronic myelogenous leukemia K562 cells
  SHEN Ning, DAI Qiao-mei, ZHAO Wei, GE Peng-ling*
  (Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)
  [Abstract]  Objective  To discuss the function of miR-181 in chronic myelogenous leukemia (CML) K562 cells. Methods  Construct the miR-181a overexpression lentiviral vector, to evaluate the differentiation degree of K562 cells to erythroid cells by observing the expression of CD235a and gamma globulin, to evaluate the differentiation degree of K562 cells to megakaryocytic cells by observing the expression of CD61 and CD41, and their expression levels were detected through real-time PCR. To detect cell proliferation by CCK experiments. Results  The overexpression of miR-181a in K562 cells can increase the expression levels of CD235a, gamma globulin, CD61 and CD41 after hemin and phorbol-12-myristate-  13-acetate (TPA) induction(P<0.05); furthermore, the overexpression of miR-181a could significantly inhibit the proliferation of K562 cells(P<0.05)。 Conclusion  The overexpression of miR-181a promotes the differentiation of K562 cells and inhibits the proliferation of K562 cells.
  [Keywords]  miR-181a; K562 cells; differentiation; proliferation
  引  言
  MicroRNAs被发现主要在转录后水平调控目标基因的表达水平。他们由两个RNaseШ酶(Dicer 和Drosha)逐步剪切一段具有发夹环结构的单链RNA而形成。这些成熟的microRNAs与其他蛋白质一起组成RNA诱导的沉默复合体(RISC),通过与其靶mRNA分子的3’端非编码区域互补匹配,导致靶向mRNA降解和/或翻译抑制[1-2]。MicroRNAs已经被确定参与白血病发生。miR-181是一个最近在白血病发生中被广泛研究的miRNA。研究发现miR-181在小鼠骨髓B淋巴细胞优先表达,在造血干/祖细胞异位表达导致B系的比例增加[3]。miR-181在选择性T淋巴细胞白血病的进展中也是至关重要的[4-6]。此外,miR-181被发现在B细胞淋巴细胞白血病中与Tcl1的表达水平呈负相关[7]。他们进一步阐明高表达Tcl1促进B细胞淋巴细胞白血病的发生发展,miR-181的低表达是其中一个至关重要的原因[8]。也有研究报道,在细胞遗传学正常的急性髓系白血病中 miR-181家族的表达下调提示预后不良[9]。然而,到目前为止,miR-181在慢性粒细胞白血病(CML)中的作用是未知的。在本研究中,我们发现miR-181a过表达促进K562细胞分化并抑制其增殖。
  1  材料与方法
  1.1  细胞培养
  慢性粒细胞性白血病细胞株K562细胞购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。细胞培养条件:DMEM培养基(Gibico公司,美国)、10%胎牛血清(Gibico公司,美国)、青霉素(100u/毫升)、链霉素(100μg/毫升),在37°C和5%的二氧化碳孵箱中培养。
  1.2  细胞增殖实验
  将2×105细胞接种到10厘米培养皿中,完全培养基,在37°C和5%的二氧化碳孵箱中培养。间隔时间加入CCK后,利用酶标仪测OD值,进行细胞计数,然后根据不同时间点细胞数量绘制细胞生长曲线。
  1.3  氯高铁血红素和佛波醇诱导K562细胞分化
  K562细胞被接种到DMEM培养基中的密度为5×105/毫升,补充氯高铁血红素(Sigma公司,德国)到终浓度50μM以诱导K562细胞向红系分化;或者在DMEM培养基中补充佛波醇(Sigma公司,德国)到终浓度25μM以诱导K562细胞向巨核系分化。
  1.4  实时定量PCR(Real-time PCR)
  使用Bio-Rad牌PCR仪进行Real-time PCR检测(Bio-Rad仪器,美国),使用SYBR预混荧光染料(Roche公司,美国),实验步骤根据产品说明书的指示进行。应用2-??CT方法分析基因的相对表达量。GAPDH和U6分别作为mRNA和microRNAs的内参。miR-181a和U6引物被用于逆转录。
  2  实验结果
  2.1  慢病毒载体介导miR-181a在K562细胞中过表达
  为了使miR-181a在白血病细胞株K562细胞中稳定过表达,我们构建了miR-181a过表达的慢病毒载体,包装后获得慢病毒颗粒,并用于感染K562细胞,流式细胞仪分选稳定细胞。然后通过real-time PCR 进行检测miR-181a的过表达效率,结果证明miR-181a在K562细胞中过表达12倍(图1)。
  图1. 慢病毒载体介导miR-181a过表达
  2.2  MiR-181a过表达能够促进K562细胞向红系分化
  K562细胞向红系分化通过联苯胺染色评价,氯高铁血红素诱导后观察CD235a和γ 球蛋白的表达。结果表明,miR-181a在K562细胞中过表达能够增强CD235a的表达(图2A,P<0.05) 和γ 球蛋白的表达(图2B,P<0.05)。这表明miR-181a促进K562细胞向红系分化。
  图2. miR-181a促进K562细胞向红系分化
  2.3  MiR-181a过表达能够促进K562细胞向巨核系分化
  K562细胞向巨核系分化通过CD61和CD41评价,佛波酯诱导后观察CD61和CD41的表达。结果表明,miR-181a在K562细胞中过表达能够增强CD61的表达(图3A,P < 0.05)和CD41的表达(图3B,P < 0.05),这表明miR-181a促进K562细胞向巨核系分化。
  图3. miR-181a促进K562细胞向巨核系分化
  2.4  MiR-181a抑制K562细胞的增殖
  研究表明,造血细胞在分化过程中伴有增殖能力的降低。我们通过CCK实验检测miR-181a对K562细胞增殖的影响。结果表明,miR-181a过表达能够明显抑制K562细胞的增殖(图4)。
  图4. miR-181a抑制K562细胞的增殖
  3  讨论
  研究表明,根据肿瘤的类型不同miR-181既可以是一个抑癌基因又可以是一个致癌基因。激活NF-κB引起的miR-181下调提示ER+乳腺癌患者的临床预后不良[10]。在人类神经胶质瘤中,miR-181a和miR-181b可以诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖[11]。miR-181a的低表达引起结直肠癌分化差以及患者生存时间缩短[12]。此外,miR-181下调对B细胞慢性淋巴细胞白血病的进展的发展是至关重要的[8]。miR-181的缺失也提示常急性髓细胞性白血病患者的预后不良[9]。这些结果表明,miR-181是一个抑癌基因。然而,miR-181被观察到可以促进乳腺癌的进展[13, 14]。另外,在肝癌中miR-181家庭的成员的表达上调,miR-181能够促进肝癌的发生及癌症细胞迁移[15, 16]。这些结果则提示miR-181在某些类型的肿瘤中也是一个致癌基因。
  在本研究中,我们通过氯高铁血红素和佛波醇诱导K562细胞分化,结果发现miR-181a可以诱导K562细胞向红细胞及巨核细胞分化。既然miR-181a可以诱导K562细胞分化,那么,miR-181a对K562细胞增殖可能产生影响。接下来,我们又评价了miR-181a对K562细胞增殖的影响。我们的研究结果证明,miR-181a可以抑制K562细胞的增殖。综上所述,我们发现miR-181在白血病细胞系K562细胞中作为一个抑癌基因发挥作用,这种效应可能的机制:miR-181a通过诱导K562细胞分化,进而抑制K562细胞的增殖,从而起到抑制K562细胞生长的作用。
  参考文献
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  基金项目:黑龙江省自然科学基金项目(留学归国基金项目),项目名称:《基于IR大鼠全基因组表达谱的西洋参总皂苷改善IR作用机制研究》(2012.1-2014.12),项目编号:LC2011C03,经费:5万元;
  黑龙江省中医管理局科研项目,项目名称:《电针不同腧穴对压力负荷性大鼠心肌肥厚影响的实验研究》,项目编号:ZHY12-Z057,经费:0.2万元。
  第一作者:沈宁(1980-)女,黑龙江中医药大学 基础医学院 生理教研室 讲师,硕士,主要从事针灸生理学教学与科研。15590875160,waningsn@163.com
  通讯作者:葛鹏玲(1974-)女,教授,博士,黑龙江中医药大学 基础医学院 药理教研室主任,中西医结合基础学科后备带头人,硕士研究生导师,主要从事药理学研究。
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